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布鲁氏菌病的主要根据流行病学、临床特征和实验室检查。发现可疑患病动物时，应首先观察有无布鲁氏菌病的特征，如流产、胎盘滞留、关节炎或睾丸炎，了解传染源与患病动物接触史，然后通过实验室的病原学、血清学或分子生物学方法检测进行确诊。

目前常用血清葡萄糖琼脂、胰蛋白大豆琼脂等培养基进行分离培养，有时也用选择培养基如Farrell氏培养基进行分离培养。通过布鲁氏菌菌落形态、生长特性、氧化酶及过氧化氢酶试验、病料直接涂片染色镜检等来鉴定布鲁氏菌。

分离布鲁氏菌是最可靠、最准确的诊断方法。通常是取流产胎儿、胎盘、阴道分泌物、乳汁和血液作病料，直接镜检或分离后再接种培养基，如病料有污染可以用选择性培养基。但细菌学操作复杂，分离培养条件要求苛刻，且耗时长，受采样时机等因素的影响很大，检测结果误差大，所以目前对于布病的诊断多采用血清学试验。

血清学诊断包括凝集反应、沉淀反应、补体结合反应、变态反应、酶联吸附试验等。现在常用于布鲁氏菌普查的主要方法是虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验、补体结合试验、乳环试验、酶联免疫吸附试验等血清学方法。

（1）试管凝集试验（SAT）

参照行业标准SN/T-，设定待检血清稀释度（牛、马、骆驼用1:50，1:，1:，1:，猪、山羊、绵羊和狗用1:25，1:50，1:，1:），取适量减半稀释的血清于试管中，加入等量抗原（1:20稀释），各管反应总量为1ml，则血清稀释度达设定要求。试验设阴性对照，阳性对照和抗原对照，并用抗原配置比浊管作为判断凝集反应程度的依据。所有试管充分震荡后在37℃作用20h左右。

SAT是我国布病诊断的法定方法，但是该方法不适于现场应用，单独使用时特异性较差，且不能区分人工感染和自然免疫。部分感染动物的抗体滴度不到诊断水平，也易造成误诊和漏诊。

（2）虎红平板凝集试验（RBPT）

取被检血清0.03ml与抗原0.03ml在平板上相混合，4分钟内观察结果，对照凝集反应判断标准，凡出现“+”以上反应者判为阳性。RBPT用PH（3.8±0.2）高浓菌液经标准血清标化，以虎红染料（四氟四碘荧光素钠盐）染色菌体，主要特点是抑制引起非特异性反应的IgM和IgG的活化，该方法的特异性高于试管凝集试验。

虎红平板凝集试验主要用于初筛，由于其特异性不高，受试验温度和凝集时间相对较短的影响，不易准确判定结果，故对RBPT阳性者，还必须经CFT或其他辅助诊断试验检测为阳性才能最终判为阳性。

（3）乳环试验（MRT）

细胞抗原用苏木精染色后加入乳中，如果乳中有抗体存在，一部分会结合到琼脂球上并与抗原发生凝集反应，由于乳脂比重小，浮于乳液表面，在乳脂层将形成一个紫色的环状带。取新鲜牛、羊乳1ml，放在小试管内，加入1滴乳环抗原（0.03-0.05ml），充分混匀，置于37℃温箱中或水浴中，1小时后判定结果。该方法是奶牛布鲁氏菌病监测的主要方法。但需要的样品份数多，且受乳品状况影响。

（4）补体结合试验（CFT）

CFT法原理是补体能与抗原抗体复合物结合，但不能同单独的抗原或抗体结合。试验需要两个系统（待检系统、指示系统）及补体。在抗原和补体的混合物中加入待检样品，37℃反应一段时间后加入作为指示系统的致敏绵羊红细胞，混匀后37℃反应。如果样品含有抗体，则补体与待检系统结合，指示系统不发生溶血。根据溶血程度来判断阴阳性。

CFT是OIE推荐的确诊试验。但由于大量不同试剂及各种各样的对照组，试验步骤多，结论也具有主观性，且不能鉴别人工免疫和自然感染，实验条件复杂苛刻，基层兽医站难以应用。在CFT方法的基础上，发展了改良的微量CFT，检查感染羊种布鲁氏菌的绵羊，发现该方法比常规CFT价廉、快速，且适于自动化和易于标准化。

（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是一种与CFT效果相当的试验，操作更方便，既可以作为确定试验，又可以作为筛选试验。但只有用于牛种布病的ELISA是国际贸易指定试验。这种ELISA方法不但用于血清学诊断，还可用于乳汁检查。猪种布鲁氏菌和绵羊附睾种布鲁氏菌已有比较成熟的ELISA诊断技术。目前应用较多的是间接ELISA，最常用的设计是使用聚苯乙烯包被光滑型脂多糖抗原（SLPSAg），其特异性较高。用聚苯乙烯包被粗糙型脂多糖抗原（RLPSAg）诊断绵羊附睾种布病特异性较高。间接ELISA的缺点是不能分辨出接种疫苗与自然感染产生的抗体。

竞争性ELISA敏感性和特异性好，可以鉴别布病的自然感染和人工免疫。其关键在于选择针对OPS共同抗原的特异性单克隆抗体，且亲和力介于疫苗产生的抗体与野毒感染产生的抗体之间。操作时包被脂多糖抗原，加入单抗及待检血清，温浴后洗涤，加入酶标记的抗单抗结合物，温浴后显色，根据显色深浅或终止显色后测吸光度，通过计算抑制率判断反应程度。另外还有斑点ELISA（Dot-ELISA），双抗原夹心酶免疫试验，免疫胶体金标记技术等检测方法。

（6）荧光偏振试验（FPA）

一种新型的检测方法，其基本原理是溶液中的荧光分子在收到偏振光激发时，如果在激发时分子保持静止，该分子将发出固定偏振平面的发射光（发射光仍保持偏振性）。然而如果分子旋转或翻转，则发射光的偏振平面将不同于初始激发光的偏振平面。分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例，若分子体积大，那么旋转慢。偏振值高。待检血清稀释后在仪器上度数，加入用荧光素标记的分子量22KD左右的布鲁氏菌抗原，温育几分钟，若抗体存在，则与标记抗原结合后就会降低标记抗原的转动速度，并可用仪器测定出转动速率的变化，读出偏振值，高于临界值的判为阳性。该方法可以检测血清、全血和奶样，操作简单、快速，敏感性和特异性高，几乎与竞争性ELISA相同，适合野外诊断用。

（7）沉淀试验

利用红细胞提取物做抗原，沉淀试验最早鉴别出免疫动物和自然感染动物。由于凝集试验不适合诊断绵羊附睾种布病的诊断，琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验就成为绵羊附睾种布病的常用诊断方法。该试验使用羊布鲁氏菌的多糖B做抗原，利用可溶性抗原与可溶性抗体在含有电解质的琼脂网状基质中向四周自由扩散，由近及远形成浓度梯度的原理而进行的。当抗原和抗体在琼脂基质中适合比例下相遇，便可相互结合，产生抗原抗体复合物，出现肉眼可见的沉淀线。

对于猪种布病，传统的血清学都不适用，主要原因是断奶后2-3月龄的猪最易感，但对凝集类抗体的应答有限，并且与耶尔森菌o:9的感染在猪群中非常普遍，而传统血清学所用抗原的主要成分S-LPS与耶尔森菌的LPS难以区分。另外猪的补体会干扰豚鼠补体而使补体结合试验敏感性下降。因此，对猪布鲁氏菌病的诊断，流行病学显得尤为重要。荧光偏振试验已用于猪种布鲁氏菌病的鉴别诊断，可排除与耶尔森菌的交叉反应。变态反应对猪种布病有很高的特异性，且不会与耶尔森菌发生交叉反应，但敏感性与凝集试验一样比较差，不适合用于猪个体的诊断。

（8）皮内变态反应试验

当机体受布鲁氏菌抗原作用后，导致T细胞致敏，致敏的T细胞再遇到相同抗原，能释放出各种淋巴因子。局部皮肤变态反应就是各种淋巴因子作用的结果。检查羊时，在尾部注射0.1ml布鲁氏菌素。检查牛时，在牛的眼结膜滴0.1ml布鲁氏菌素。24h及48h各观察一次，在羊尾部能触摸到肿块为阳性，牛的眼结膜充血为阳性。此法对慢性病例检出率较高，并且注射布鲁氏菌素后无抗体产生，不妨碍以后得血清学检查。此法主要用于山羊和绵羊的检疫，但山羊的变态反应试验不如绵羊变态反应试验那样易读取结果，对中后期病羊的诊断意义较大，适用于山羊布鲁氏菌病的筛查，不作个体山羊的诊断依据。

包括DNA同源性研究、DNA限制性内切核酸酶图谱分析、PCR扩增、核酸探针检测。目前PCR技术作为布病病原的诊断技术已得到越来越多的应用。最早检测布鲁氏菌的基础PCR是针对布鲁氏菌上高度保守的单个基因（BCSP31、16SrRNA）而设计的，主要是用于鉴定布鲁氏菌种的类型。用PCR能够区别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌，之后又发展出用PCR方法将布鲁氏菌牛种（1、2、4型）、羊种（1、2、3型）、猪种（1型）、绵羊附睾种区分鉴别。

国外研究者应用PCR-RFLP技术研究了77株来自不同区域（包括6种不同种属和生物型）不同布鲁氏菌中25KD和36KD两种主要外膜蛋白基因的多态性，发现不同布鲁氏菌之间omp2基因的差异，以omp2a和omp2b为探针进行DNA-DNA杂交或RFLP分析，可以对不同布鲁氏菌进行分型及诊断。利用布鲁氏菌16s-23srRNA间隔区中有一段bpDNA的保守序列设计布鲁氏菌特异性引物和核酸探针，通过巢式PCR法，检测奶中布鲁氏菌。

根据IS在不同种及生物型布鲁氏菌基因组中的位置及数目各不相同的特点，设计出IS锚定PCR法，可用于鉴定布鲁氏菌并区分不同种株和生物型，最具意义的是鉴别野毒株与疫苗株S19。S19和RB51疫苗菌株均已可以用PCR技术鉴定：S19的赤鲜醇敏感基因缺失bp（其他布鲁氏菌都有bp，S19只有bp）；RB51菌株编码葡胺聚糖酶的wboA基因发生了变异。

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